Abstract

CRISPR / Cas9 (Clustered Shortly Palindromic Repeats, Clustered Regularly Interspaced / CRISPR associato alla proteina CAS9) è uno strumento di modifica del genoma che è stato ampiamente utilizzato negli ultimi cinque anni a causa della sua novità, accessibilità e fattibilità. Questa tecnologia è stata sviluppata in molte specie vegetali per l’analisi della funzione genica e il miglioramento delle colture, ma non è mai stata utilizzata nella cicoria (Cichorium intybus L.). In questo studio, abbiamo applicato con successo la mutagenesi mirata mediata da CRISPR / Cas9 alla cicoria utilizzando la trasformazione mediata da Agrobacterium rhizogenes e i metodi di trasfezione del protoplasto. Un promotore U6 (CiU6-1p) tra otto promotori U6 previsti in cicoria è stato selezionato per guidare l’espressione di sgRNA. Un vettore binario progettato per indurre mutazioni mirate nel quinto esone del gene della fitoene desaturasi della cicoria (CiPDS) è stato quindi costruito e utilizzato per trasformare la cicoria. La frequenza di mutazione era del 4,5% con il sistema di espressione transiente protoplasto e del 31,25% con trasformazione stabile mediata da A. rhizogenes. Mutazioni bialleliche sono state rilevate in tutte le piante mutanti. L’uso della trasformazione mediata da A. rhizogenes sembra preferibile in quanto la rigenerazione delle piante è più veloce e la frequenza della mutazione è risultata più alta. Con entrambi i metodi di trasformazione, il DNA estraneo era integrato nel genoma della pianta. Quindi, è richiesta la selezione di segregants senza transgeni. I nostri risultati hanno dimostrato che l’editing genomico con il sistema CRISPR / Cas9 può essere efficacemente utilizzato con la cicoria, che dovrebbe facilitare e accelerare il miglioramento genetico e la biologia funzionale.

1-Introduzione

L’editing del genoma, che consiste nel mirare e digerire il DNA in un sito specifico del genoma, è uno strumento importante per l’analisi della funzione genica e il miglioramento del raccolto [1]. Ad oggi, sono state sviluppate tre tecnologie specifiche di modifica del genoma: nucleasi con dita di zinco (ZFN) [2], nucleasi effettore di trascrizione attivatore-simile (TALENs) [3] e proteina associata (CRISPR) con breve ripetizione palindroscopica intercalata (CAS) sistema). Questi metodi inducono rotture a doppio filamento (DSB) nel DNA mirato. Nelle cellule eucariotiche, queste rotture possono essere riparate in due diversi percorsi: il non-homologous end-join (NHEJ) e la ricombinazione omologa (HR). NHEJ è il meccanismo di riparazione DSB più comunemente usato in molti organismi e può causare inserimenti o delezioni che possono potenzialmente produrre un knockout del gene [4]. In condizioni naturali, il sistema CRISPR / Cas9 utilizza un CRISPR RNA (crRNA) e un piccolo CRISPR RNA transattivante (trancrRNA), che può ibridarsi per formare il doppio crRNA maturo. L’endonucleasi CAS9 forma un complesso di ribonucleoproteine ​​con il crRNA, che guida l’endonucleasi verso un DNA bersaglio specifico. La scissione è possibile solo se il complesso riconosce una sequenza di semi breve a monte di un motivo adiacente al protospacer (PAM) 5′-NGG-3 ‘[5]. Grazie all’ingegneria della biologia molecolare, crRNA è stato sostituito da un RNA chimerico a guida singola (sgRNA). Di conseguenza, solo lo SGRNA e l’endonucleasi CAS9 sono necessari per tagliare e creare DSB in loci specifici nel genoma delle cellule. Per la sua semplicità, basso costo, versatilità e alta efficienza, il sistema CRISPR / Cas9 è diventato la tecnologia più utilizzata per l’editing del genoma in
molti organismi come batteri, lieviti, animali e piante.

Negli impianti, il sistema CRISPR / Cas9 viene spesso inserito in un vettore contenente ilCAS9 a monte di un forte promotore onnipresente come i promotori di ubiquitina o Cauliflower Mosaic Virus (CaMV) 35S. Inoltre, i promotori specifici della linea germinale, come il CDC45, che hanno il vantaggio di essere attivi nella fase meiotica / zigotica, sono stati recentemente usati con successo [6]. Per consegnare la proteina CAS9 al genoma nucleare, una sequenza di segnale di localizzazione nucleare (NLS) viene fuso con il gene CAS9. Per esprimere lo sgRNA, vengono utilizzati promotori di RNA polimerasi-III come U6 e U3. Il nucleotide di iniziazione del trascritto è G e A nel promotore di U6 e nel promotore di U3, rispettivamente [7]. Utilizzando la tecnologia di clonazione Golden Gate, che utilizza enzimi di restrizione di seconda generazione [8], è possibile inserire facilmente numerosi SGRNA e il gene CAS9 in un vettore di espressione singola, al fine di indirizzare simultaneamente diversi siti di DNA [9].

I protoplasti sono stati utilizzati in Arabidopsis e tabacco, ma anche in specie coltivate come mais, riso, frumento, soia e pomodoro. Tuttavia, la rigenerazione delle piante da protoplasti mutati è rara perché molte specie di piante non possono essere rigenerate da colture di protoplasti, in particolare le monocotiledoni. Inoltre, il processo di rigenerazione è lungo e soggetto a contaminazione. Questo approccio è quindi spesso utilizzato come fase preliminare per valutare la funzionalità del sistema CRISPR / Cas9 prima di utilizzarlo con un metodo di trasformazione più appropriato come la trasformazione mediata da A. tumefaciens.

Tuttavia, non tutte le specie vegetali possono essere trasformate con questi metodi. In questo caso, possono essere utilizzate altre tecniche come la trasformazione mediata da biologia o da A. rhizogenes. R. rhizogenes è stato ampiamente utilizzato per la trasformazione delle piante per studiare la rizosfera o le vie metaboliche. La modifica del genoma usando la trasformazione mediata da A. rhizogenes è stata effettuata con successo in pomodoro (Solanum spp), soia (Glycine max), Brassica carinata, Salvia miltiorrhiza. Tuttavia, solo poche piante hanno la capacità di rigenerarsi dalle radici delle radici pelose, il che ne ostacola l’uso nell’editing del genoma.

La cicoria (Cichorium intybus L.), un’asteraceae, è ben nota nella medicina tradizionale. Più di 100 singoli composti sono stati isolati da questa pianta, in particolare dalle sue radici che sono ricche di metaboliti specializzati (noti anche come metaboliti secondari o prodotti naturali vegetali) come polifenoli e terpenoidi. Grazie alla loro capacità di produrre composti preziosi, le radici pelose e le colture cellulari sono state create dai biotecnologi. È stato segnalato che i metaboliti specializzati presenti nella cicoria esercitano molte attività biologiche come attività antiossidanti, antitumorali, antinfiammatorie o anti-epatotossici con effetti benefici sulla salute negli esseri umani e nel bestiame.

La cicoria è anche utilizzata come coltura vegetale, per insalata di foglie chiamata chicon o witloof o come sostituto del caffè. Inoltre, le radici di cicoria hanno un contenuto di inulina che può raggiungere il 40%. L’inulina è un polisaccaride usato come sostituto dello zucchero a causa del suo basso valore calorico. La cicoria è utilizzata per più applicazioni. Ciò ha portato alla coltivazione su larga scala e quindi a un interesse per la cicoria geneticamente modificata per migliorare le rese e le proprietà nutrizionali e quindi estendere il suo potenziale. La mutagenesi mirata che utilizza la tecnologia CRISPR / Cas9 potrebbe potenzialmente essere utilizzata nella cicoria come strumento efficace per studiare la funzione genica e generare nuove varietà. Il successo della mutagenesi mirata con il metodo CRISPR / Cas9 dipende dall’efficienza dei diversi componenti molecolari (progettazione di sgRNA, CAS9, promotori …) ma principalmente dalla capacità della specie di essere trasformata e di rigenerare le piante. La trasformazione mediata dalla cicoria di tumefaciens della cicoria è fattibile ma dipende dal genotipo, mentre la sua trasformazione con A. rhizogenes è abbastanza efficiente e la rigenerazione delle piante dalle radici pelose è possibile. Questo potrebbe fornire un approccio veloce per l’editing del genoma della cicoria. Questa strategia è già stata utilizzata in Taraxacum kok-saghyz. Altrimenti, la fusione del protoplasto mediata da PEG è già stata applicata per indurre la sterilità maschile nella cicoria e i protoplasti fusi sono in grado di rigenerarsi. L’uso di protoplasti per l’editing del genoma potrebbe essere un’alternativa nel caso della cicoria.

In questo studio, abbiamo eseguito un editing efficiente del genoma multiplex in cicoria nella prima generazione (T0), utilizzando due sgRNA e CAS9. Entrambe le trasformazioni stabili mediate da A. rhizogenes e il sistema transitorio di espressione del protoplasto sono state applicate con successo al genoma della cicoria dell’ingegnere. Come prova di principio, siamo stati in grado di eliminare il gene CiPDS (fitoene desaturasi) in piante rigenerate da radici pelose e protoplasti. Con gli sgRNA specifici di CiPDS, sono state generate diverse linee albine indipendenti. Viene quindi fornito un metodo efficace che può essere utilizzato per la mutagenesi della cicoria.

2-Risultati

2.1. Predizione di Sequenze Promotore U6 in Cicoria
I promotori di U6 RNA polimerasi-III sono tipicamente utilizzati per guidare l’espressione di sgRNA in Dicots. Il promotore di Arabidopsis U6-26 è stato utilizzato per generare sgRNA in numerose specie di piante, come la soia, il cotone o la miltiorriza di Salvia. Per identificare i promotori di U6 in cicoria, la sequenza di piccolo RNA nucleare (snRNA) di Arabidopsis U6-26 è stata utilizzata per cercare il genoma della cicoria (database non pubblicato di Florimond Desprez SA). Otto sequenze U6 (denominate da U6-1 a U6-8) con la più alta somiglianza con la sequenza di Arabidopsis sono state selezionate per ulteriori analisi.

I promotori di polimerasi-III esprimono trascritti con purina, cioè a G come nucleotide di iniziazione. Come previsto, una G si trovava proprio di fronte a tutte le sequenze di snRNA della cicoria. Tutti gli snRNA, incluso quello di Arabidopsis, erano molto simili. Le sequenze del promotore di U6 contengono due elementi conservati essenziali per l’inizio della trascrizione da parte della RNA polimerasi-III: l’elemento della sequenza a monte (USE, sequenza di consenso RTCCCACATCG) e una scatola di tipo TATA (sequenza di consenso TTTATATA). La sequenza USE di U6-7 (GenBank accession MK455778) e U6-8 (GenBank accession MK455779) e la scatola simile a TATA di U6-6 (GenBank accession MK455777) sono leggermente diversi dagli altri. U6-1 (GenBank accession MK455772), U6-2 (GenBank accession MK455773), U6-3 (GenBank accession MK455774), U6-4 (GenBank accession MK455775) e U6-5 (GenBank accession MK455776) potrebbero essere buoni candidati per la guida l’espressione di sgRNA in cicoria. Il promotore U6-1 (CiU6-1p) è stato scelto a caso e utilizzato per i seguenti esperimenti.

2.2. Target Selection e Plasmid Construction per il sistema CRISPR / Cas9

Un esperimento di prova del principio ha dimostrato che il gene CiPDS (fitoene desaturasi) è stato eliminato con successo in piante rigenerate da radici pelose e da protoplasti.
Il PDS è un enzima chiave per la biosintesi della clorofilla e i mutanti PDS sono facilmente rilevabili a causa del loro fenotipo albino. Per identificare i geni putativi del PDS, una ricerca TBLAST del genoma della cicoria (database non pubblicato di Florimond Desprez SA) è stata condotta con sequenza di proteine ​​PDS di Helianthus annuus (Asteraceae) (accessione di GenBank AHA36971.1) come domanda. È stato selezionato il gene con la somiglianza più elevata. È stata prevista solo una copia del gene. CiPDS (GenBank accession MK455771) è un gene di lunghezza 2514 pb e ha 10 esoni, con 1746 nucleotidi della sequenza di trascrizione che codificano 581 amminoacidi. Per eliminare il gene, sono state progettate 2 sequenze target (doppie mutazioni) nel quinto esone. Utilizzando il software “crispor.tefor.net”, sono stati selezionati 2 RNA guida in base alla posizione della sequenza target e al contenuto del GC. Ci si aspettava che la nucleasi CAS9 fosse stata tagliata due volte nell’esone 5 a monte del PAM.

Il nostro obiettivo era quello di produrre un vettore binario che ospitasse 2 sgRNA e il CAS9 per l’editing genico nella cicoria. Il primo passo è stato costruire un plasmide con CiU6-1p e lo scaffold sgRNA, in cui una guida RNA (gRNA) può essere facilmente inserita. Per questo, abbiamo progettato un vettore di sub-clonatura contenente CiU6-1p, seguito da un indicatore di selezione del contatore (lacZ-ccdB, ccdB sotto il controllo del promotore LacZ inducibile di Isopropyl β-D-1-Thiogalactopyranoside (IPTG)) affiancato da 2 siti di riconoscimento BbsI e lo scaffold sgRNA. Questa sequenza è stata sintetizzata e inserita in pUCIDT-Kan per dare pKanCiU6-1p-sgRNA. BbsI è un enzima di seconda generazione che produce estremità appiccicose distinte non palindromiche al di fuori del suo sito di riconoscimento. Questa funzione è utile in questo caso. Infatti, un G deve essere posizionato direttamente a monte del CiU6-1p per iniziare la trascrizione e il gRNA deve essere posizionato di fronte allo scaffold sgRNA. I 19 pb degli gRNA con adattatori specifici sono stati sintetizzati come due coppie complementari di oligonucleotidi (Tabella A1) come descritto da Ma e Liu e inseriti in pKanCiU6-1p-sgRNA mediante digestione / legatura per produrre il plasmide pKanCiU6-sgRNA. Per ogni guida è stato generato un plasmide (pKanCiU6-1p-sgRNA1 e pKanCiU6-1p-sgRNA2. Le cassette complete sono state amplificate con specifiche coppie di primer (GG1-F, GG1-R e GG2-F, GG2-R) progettate per la clonazione Golden Gate e inserite nel vettore di espressione pYLCRISPR / Cas9P35S-B. Usando questo protocollo, vector pYLCRISPR-sgRNA1-sgRNA2 progettato per co-esprimere due sgRNA e la nucleasi CAS9 in cicoria è stata costruita entro una settimana.

2.3. Rigenerazione di piante modificate da CRISPR da protoplasti e da linee di radici pelose

 Sono stati usati due metodi di trasformazione per esprimere il sistema CRISPR / Cas9 in cicoria: la trasformazione del protoplasto mediata con PEG e A. La trasformazione stabile mediata da rhizogenes. I protoplasti sono stati trasformati con il pYLCRISPR-sgRNA1-sgRNA2, trasferito al mezzo di crescita per ottenere calli, e quindi la rigenerazione delle piante è stata indotta su un mezzo di rigenerazione. Come controllo, sono state ottenute piante rigenerate da protoplasti seguendo gli stessi protocolli ma senza aggiunta di plasmidi. L’albino e le piante verdi sono state ottenute 5 mesi dopo la trasformazione. A partire da 198 calli risultanti da un esperimento di trasformazione, 9 calli hanno sviluppato germogli albini (4,5%, vedi sotto per conferma genetica). Questi dati mostrano che è possibile ottenere piante di cicoria mutate da protoplasti trasformati con il metodo PEG-mediato.

Per quanto riguarda la trasformazione stabile con A. rhizogenes e per dimostrare che le radici pelose trasformate sono in grado di rigenerare le piante con genomi modificati, la cicoria è stata infettata con A. rhizogenes ceppo 15834 trasformato con il plasmide binario pYLCRISPR-sgRNA1-sgRNA2 o meno (usato come controllo ). Due settimane dopo la trasformazione di A. rhizogenes, 32 linee di radici pelose sono state generate da giovani foglie ferite da batteri che ospitano il vettore pYLCRISPR-sgRNA1-sgRNA2. Le linee sono state coltivate su terreno MS / 2 con 300 mg / L di ampicillina per rimuovere gli agrobatteri. Dalle 32 linee selezionate sono stati generati 10 albini e 22 linee verdi. Questi risultati sono stati ulteriormente confermati a livello genetico (vedi sotto). Le linee non albine sono cresciute più rapidamente delle linee albine. Dalle 10 linee albine, 4 linee rigenerano spontaneamente le piante albine. Gli altri hanno rigenerato le piante di albino dopo la coltivazione sul terreno di induzione di germogli MC4 tipicamente utilizzato per la rigenerazione della cicoria.

2.4. Identificazione di eventi mutazionali in piante modificate dal genoma

Per confermare l’editing del genoma a livello molecolare e per caratterizzare le mutazioni, abbiamo estratto il DNA genomico da tutti i diversi materiali albini (calli, radici pelose, piante rigenerate). Il DNA dalle radici delle radici pelose è stato estratto prima della rigenerazione dei primi germogli albini. La cicoria è una specie diploide e i geni hanno una copia in ciascun cromosoma omologato. Quindi, il sistema CRISPR / Cas9 può indurre due tipi di mutazioni nel gene mirato. Da un lato, solo uno degli alleli può essere mutato, portando a una cosiddetta mutazione monoallelica. Questo tipo di mutazione non fornisce un knock out completo del gene mirato perché l’altro allele rimane wild-type. D’altra parte, i due alleli possono essere mutati che produce una mutazione biallelica. In questo caso, se i due alleli condividono la stessa mutazione, la mutazione biallelica è omozigote, ma se le mutazioni sono diverse, la mutazione biallelica è eterozigote.

Per determinare e caratterizzare i diversi tipi di mutazioni ottenuti nei nostri esperimenti, abbiamo amplificato la regione PDS includendo le due sequenze target, utilizzando coppie di primer specifici dell’esone 5 (E5-F ed E5-R) e sequenziata la reazione a catena della polimerasi (PCR) prodotti (circa 420 bp). Sono stati rilevati tutti i tipi di mutazioni. Le mutazioni bialleliche monoalleliche ed eterozigoti che producono cromatogrammi di sequenze sovrapposte da sequenziamento diretto sono state decodificate usando il metodo di decodificazione degenerata. L’analisi delle mutazioni ha confermato che tutte le piante di albino T0 contenevano alleli mutanti nel gene PDS per almeno uno dei due siti mirati (Figura 4 e Figura 5). L’efficienza di mutazione del primo bersaglio (target 1) differisce tra i due tipi di trasformazione: 66,6% con trasformazione di protoplasti e 90% con trasformazione mediata da A. rhizogenes. Non sono state osservate differenze per l’obiettivo 2. La maggior parte degli eventi di mutazione erano piccoli inserimenti (uno o due bp) o piccole delezioni (meno di 19 pb) molto probabilmente a causa del meccanismo di riparazione di NHEJ. Tuttavia, in alcuni casi, il frammento inter-guida è stato completamente cancellato, risultando in una cancellazione più grande.

Questa eliminazione inter-guida può essere rilevata prima del sequenziamento mediante elettroforesi su gel di agarosio. In tutte le piante albine analizzate, sono state trovate mutazioni bialleliche responsabili del knockout genetico per almeno uno dei due siti bersaglio. Nella maggior parte dei casi, l’inserimento o la cancellazione di un nucleotide nella sequenza bersaglio ha indotto una terminazione anticipata della traduzione proteica. Tuttavia, una delezione del frammento inter-guida potrebbe semplicemente creare una lacuna nella proteina. In questi esempi, questo intervallo è sufficiente per indurre il knock out del gene.

L’analisi genetica di entrambe le piante albine o del calli da cui hanno avuto origine ha mostrato che condividevano la stessa mutazione. Non sono state trovate piante a mosaico, dimostrando che l’evento di mutazione è stato raggiunto nella fase protoplastica. Una linea di radice pelosa, la linea L5, non portava la stessa mutazione allo stadio di radice pelosa di un mese più tardi in fase vegetale, suggerendo che il sistema CRISPR / Cas9 potesse continuare a modificare i geni durante la fase di radice pelosa. Questo è stato precedentemente dimostrato nelle radici pelose di soia. Tutte le altre piante albine hanno la stessa mutazione della radice pelosa da cui hanno avuto origine, suggerendo che le mutazioni erano stabili in queste linee.

Tutte le linee analizzate davano un prodotto di PCR alla dimensione prevista, cioè circa 420 pb. La PCR ha prodotto un prodotto di circa 1500 pb, suggerendo che durante il meccanismo di riparazione, un grande frammento di DNA può anche essere inserito nel sito di clivaggio del DNA della proteina CAS9. Questo fenomeno è già stato osservato in Gossypium hirsutum in cui un grande frammento endogeno (99 pb) è stato inserito nel sito bersaglio della proteina CAS9. I risultati del sequenziamento della linea C8 hanno mostrato che un frammento di DNA è stato inserito nel sito target 2, in entrambi gli alleli. Questo frammento è composto da più frammenti di pYLCRISPR-sgRNA1-sgRNA2.

2.5. Rilevamento del transgene nelle piante albine

Durante la trasformazione mediata da A. rhizogenes, il DNA T del vettore binario (pYLCRISPR-sgRNA1-sgRNA2) è inserito nel genoma della pianta, così come il T-DNA del plasmide Ri (Root Inducing) contenente il geni rol responsabili del fenotipo della radice pelosa. Infatti, a causa dell’espressione dei geni di virulenza (vir) presenti sul plasmide RI, il margine destro (RB) e il margine sinistro (LB) dei due T-DNA sono riconosciuti e i due T-DNA vengono asportati, trasportati, e integrato nel DNA nucleare e quindi si verifica un evento di doppia trasformazione. Le PCR con coppia di primer specifici del gene rolB e con coppia di primer specifici CAS9 hanno mostrato che in tutte le linee di piante albine rigenerate dalla radice pelosa, i due T-DNA erano integrati nei loro genomi (dati non mostrati). Sono state eseguite ulteriori analisi per determinare se le piante derivate da protoplasti mutanti avessero integrato la sequenza CAS9. La PCR con primer specifici per CAS9 ha mostrato che 3 piante su 9 piante albino rigenerate da protoplasti contenevano almeno un frammento della sequenza CAS9. Questo mostra che i frammenti vettoriali sono inseriti nel genoma della pianta durante la procedura di trasformazione. Inoltre, il sequenziamento della pianta C8, dopo aver inserito un frammento nel sito target della guida 2, ha mostrato che questo frammento era composto da molte parti del vettore utilizzato per la trasformazione.

3-Discussione

In questo lavoro, abbiamo applicato con successo la tecnologia CRISPR / Cas9 per la prima volta nella cicoria. La tecnologia CRISPR / Cas9 è stata già utilizzata con successo per eliminare i geni in altre piante della famiglia delle Asteraceae, come la scorzonera, la lattuga e il tarassaco. Asteraceae e membri delle Brassicaceae e delle Solanacee sono sensibili a questo approccio biotecnologico a causa della loro elevata capacità di rigenerazione. Molti successi nell’editing del genoma sono stati raggiunti anche con piante appartenenti alla famiglia delle Poaceae, non a causa della loro grande capacità di rigenerarsi ma perché sono certamente più studiate. Il successo dell’editing del genoma dipende dall’attività del promotore utilizzato per guidare l’espressione dello sgRNA. Il promotore di Arabidopsis U6-26 è frequentemente utilizzato nelle piante; tuttavia, in alcune specie di piante, come nel grano e nel riso, è stato dimostrato inefficace. Uno studio sulle radici pelose della soia (Glycine max) ha anche dimostrato che il promotore Gm-U6 endogeno ha prodotto un’efficienza di mutazioni da 2 a 6 volte superiore a quella di Arabidopsis U6-26. Il genoma della cicoria è stato analizzato per i geni U6 e 8 sono stati identificati in base alla loro somiglianza con Arabidopsis U6-26. CiU6-1p è stato scelto casualmente tra i sei più conservati ed è stato usato per promuovere l’espressione di due sgRNA destinati al quinto esone del gene CiPDS. Il gene PDS è spesso usato come bersaglio per lo sviluppo del metodo. Infatti, le piante mutanti sono albine, che fornisce uno schermo visivo efficiente. Dal 2013, è stato utilizzato in molte specie come grano, riso, populus, mela, anguria, manioca e banana. Nel nostro studio, il marker di selezione, ad esempio, la resistenza di Basta presente su pYLCRISPR-sgRNA1-sgRNA2 non è stata utilizzata per la selezione di piante mutate. Tuttavia, questo può essere usato per selezionare in modo efficiente i trasformanti in altri studi.

Il sistema CRISPR / Cas9 è stato inserito in un vettore unico e il gene CiPDS è stato eliminato da due diversi metodi di trasformazione: A. Trasformazione stabile di rhizogenes e trasformazione transitoria del protoplasto con PEG. Con entrambi i metodi di trasformazione, le piante albine sono state rigenerate, con frequenze di mutazione del 31,3% per la trasformazione mediata da A. rhizogenes e del 4,5% per la trasformazione del protoplasto. Le frequenze di mutazione ottenute in altre specie sono molto variabili a causa dell’intervento di numerosi parametri, come la capacità della specie di essere trasformata, il metodo di trasformazione utilizzato, il disegno del bersaglio, il gene mirato. Ad esempio, la frequenza delle mutazioni in Arabidopsis PDS con trasfezione da PEG-protoplasto è stata dell’1,1% mentre nel tabacco è stata del 37% circa. D’altra parte, nelle radici pelose della soia la frequenza della mutazione variava dal 14,7% al 20,2% a seconda del gene mutato. In questo studio, la trasformazione mediata da A. rhizogenes ha dato una migliore frequenza di mutazione (31,25%) rispetto alla trasformazione del protoplasto (4,5%). Questo migliore tasso di mutazione può essere dovuto alla trasformazione stabile, che consente al sistema CRISPR / Cas9 di continuare la modifica del gene durante lo sviluppo della radice pelosa. Questa caratteristica può dare piante di mosaico e se l’obiettivo ha alcuni potenziali siti fuori bersaglio, questo può aumentare le mutazioni indesiderate. La progettazione dell’obiettivo è un passo cruciale per evitare la scissione fuori bersaglio nel genoma. Di conseguenza, l’accesso ai database del genoma è molto importante per la modifica del genoma utilizzando la tecnologia CRISPR / Cas9. Tuttavia, non tutte le specie vegetali hanno database genomici completi o completamente accessibili. L’accesso alla sequenza completa del genoma può facilitare la progettazione di bersagli affidabili per le mutazioni di fine-tuning. Ciononostante, è essenziale e significativo confermare se CRISPR / Cas9 possa essere applicato, agli studi di funzione genica, in piante meno studiate.

La caratterizzazione dei mutanti della cicoria ha portato all’osservazione di mutanti mono- e biallelici in piante rigenerate da entrambi i tipi di trasformazione. Nei mutanti biallelici, il materiale ideale per studiare la funzione del gene, le mutazioni sono state simultaneamente rilevate nelle posizioni desiderate in entrambi i siti mirati. Ciò dimostra che è possibile mettere fuori combattimento diversi geni contemporaneamente utilizzando entrambi i tipi di metodi di trasformazione in cicoria. Questa modifica del genoma multiplex è molto utile per l’analisi della funzione genica e con il metodo di trasformazione di A. rhizogenes, in particolare i geni coinvolti nel metabolismo specializzato. In effetti, nelle radici pelose, questo metabolismo è noto per essere molto attivo. In confronto con la trasformazione e la rigenerazione delle piante da protoplasti, è facile e veloce stabilire linee di radice pelose in cicoria. La rigenerazione delle piante è possibile entro 6 settimane dalla trasformazione e la vernalizzazione non è richiesta per la fioritura [28,29]. La fioritura si è verificata già 1 settimana dopo la rigenerazione e questo può essere un vantaggio reale nello studio dei geni coinvolti nello sviluppo dei fiori o nella riproduzione. Gli svantaggi dell’uso del metodo A. rhizogenes per produrre piante mutanti CRISPR è che i T-DNA sono stabilmente inseriti nel genoma. Questo non è un problema per molte analisi della funzione genica, ma se l’obiettivo è quello di produrre varietà commerciali, sarebbe un inconveniente, perché i T-DNA devono essere rimossi mediante autoimpollinazione e questo potrebbe essere un lungo processo in cicoria. In effetti, la cicoria è una pianta biennale ed è spesso autoincompatibile. In questo studio, abbiamo dimostrato che il DNA estraneo derivante dal vettore contenente la cassetta CRISPR / Cas9 può essere inserito a una frequenza non trascurabile (3 piante su 9 piante mutanti) nel genoma della pianta, dopo trasformazione transitoria in cicoria. Questo fenomeno è stato anche dimostrato nel tabacco, dove il DNA di Cas9 è stato trovato nel 17,2% delle piante mutanti. Ciò potrebbe essere causato da eventi HR promossi dal gran numero di plasmidi presenti nelle cellule. Inoltre, una volta nella cellula transfettata, i plasmidi vengono digeriti da nucleasi endogene e i frammenti risultanti potrebbero anche essere inseriti all’interno del genoma della pianta. Questo potrebbe spiegare l’inserimento di più frammenti di DNA vettoriale nel sito “on-target” nell’impianto mutante C8.

Questi risultati hanno mostrato che dopo la trasformazione mediata da PEG, è estremamente difficile accertare la posizione e il numero di frammenti di DNA estranei inseriti all’interno del genoma della pianta. Per ottenere piante prive di DNA estraneo sarebbe davvero una sfida. Per preparare davvero un editing genomico privo di DNA, sarà interessante utilizzare complessi di ribonucleoproteine ​​(RNP) preassemblati anziché DNA plasmidico per trasformare i protoplasti nella cicoria. Gli RNP sono stati usati in protoplasti di Arabidopsis, tabacco, lattuga e riso, attraverso la trasformazione mediata da PEG con le stesse condizioni di quando si usa il DNA plasmidico, e le frequenze di mutazione sembravano essere migliori. Pertanto, avere piante mutanti rigenerate da protoplasti trasformati con trasformazione mediata da PEG, è un risultato molto incoraggiante per l’uso di RNP in cicoria. In questo studio, abbiamo dimostrato che la tecnologia CRISPR / Cas9 potrebbe essere utilizzata per generare piante mutanti in cicoria. Entrambi i metodi di trasformazione testati erano efficaci, ma la trasformazione mediata da A. rhizogenes era più efficiente e più veloce. Abbiamo dimostrato che il sistema CRISPR / cas9 può essere utilizzato per introdurre piccole mutazioni in specifici loci nel genoma della cicoria. Questo metodo costituisce uno strumento potente e facile da usare per studiare la funzione genica nella cicoria. Per evitare l’integrazione di DNA estraneo nel genoma che impedisce la possibilità di utilizzare questo metodo per creare varietà commerciali con nuovi tratti agronomici, i nuovi sistemi di editing come gli RNP potrebbero essere valutati in cicoria.

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Articolo tradotto dalla pubblicazione di Bernard, G.; Gagneul, D.; Alves Dos Santos, H.; Etienne, A.; Hilbert, J.-L.; Rambaud, C. Efficient Genome Editing Using CRISPR/Cas9 Technology in Chicory. Int. J. Mol. Sci. 201920, 1155.
https://www.mdpi.com/1422-0067/20/5/1155/htm